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gocheck官网10月8日检测样例:

3.4.2 重组蛋白的分析及鉴定

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）的原理是SDS可以与蛋白质结合使蛋白带上大量负电荷，蛋白在电泳过程中其迁移率只与分子量大小有关，因此，该方法可以用来初步分析蛋白质的分子量及纯度。从理论上分析，本研究中的重组菌BL21(DE3)/pET-43.1b(+)-PHD2经IPTG诱导后，表达出的Nus-PHD2融合蛋白用SDS-PAGE电泳分析后应在110KDa附近出现特异性条带， 即为Nus•Tag、His•Tag等标签（66.4KDa）与PHD2（46KDa）之和。由于重组蛋白可能受到融合标签及自身所带电荷的影响，使表观分子量（约100KDa）与理论值有所偏差，但基本与预期相符。因此，仅仅通过SDS-PAGE并不能精确分析目的蛋白的分子量，后期可以通过色谱-质谱联用技术及蛋白质组学相关知识进一步分析解释。  Western Blot（蛋白免疫印迹杂交）是将蛋白样品通过SDS-PAGE按分子量大小分离后，转移到杂交膜（NC膜或PVDF膜）上，通过一抗/二抗复合物对目的蛋白上特定氨基酸序列的特异性识别进行检测的方法。Western Blot是蛋白质分析方法中最流行且最成熟的技术之一，其基本流程是：转膜、封闭、一抗杂交、二抗杂交、底物显色。本研究通过Westen Blot检测到重组蛋白能够与特异性的一抗/二抗结合，证明成功表达出PHD2蛋白，达到了研究的目的。

4.4.1 基于His•Tag标签的蛋白纯化方法

本研究表达出的重组蛋白在N端加入NusA标签后，同时也引入了His•Tag标签，二者的联用在促进融合蛋白可溶性表达的同时也有利于目的蛋白的纯化。His•Tag亲和标签是目前最常用的蛋白纯化标签，其优点是表达方便、分子量小且基本不影响目的蛋白的活性，无论目的蛋白是可溶性表达或者形成包涵体、蛋白变性或非变性条件下都可以使用。用于分离His•Tag融合蛋白的主要方法是IMAC（固定化金属螯合层析），即通过固定了配基（如IDA、NTA、CM-A和TED）的琼脂糖凝胶填料来螯合过渡金属离子（Cu2+、Ni2+、Co2+或Zn2+），从而吸附表面带有组氨酸残基的蛋白。

本章采用的Ni-NTA亲和层析原理是用亚硝基三乙酸（NTA）作为配基来连接Ni2+，然后与His•Tag组氨酸上的咪唑环形成配位键，使蛋白与NTA树脂结合，随后用适宜浓度的咪唑溶液将目的蛋白洗脱下来。有些蛋白在表达时His•Tag标签折叠在内部不能暴露在外，这便增大了纯化的难度。对于天然条件下的蛋白不能与树脂结合，可以在样品溶液中加1~2mol/L脲，使蛋白空间结构相对松散；对于变性的蛋白若加入8mol/L脲也不能被树脂吸附，可以改用6M盐酸胍溶解蛋白样品，因为盐酸胍可以打开蛋白中脲不能打开的结构使标签暴露出来；若存在二硫键，还可以加入1~2mmol/L DTT。另外，也可以在构建表达载体时把His•Tag标签加在蛋白的另外一端。

值得注意的是，在进行大量纯化之前，应对目的蛋白的表达进行细胞定位，确定其表达形式，然后通过小量纯化测试来不断摸索蛋白纯化的条件以达到最满意的效果。

4.4.2 HIF-1α羟基化反应的影响因素

在缺氧环境下，机体通过HIF作出缺氧应答反应，而HIF-α的羟基化反应是细胞中调控HIF降解的关键步骤。HIF-1α被PHDs特异性识别的脯氨酸残基是Pro402和Pro564，还有研究表明，HIF-1α中第567号位可以被PHD3羟基化。PHD2作为调节HIF-1α活性的重要因子，其催化活性受到多个因素的影响：（1）O2分子：PHD2的启动子区可以与HIF形成一个负反馈调节区，该区严格受到氧浓度的调节，从而介导HIF-1α的降解过程；（2）Fe2+及其他二价金属离子：Fe2+是HIF-1α羟基化反应的重要辅因子，但一些二价金属离子（如Mn2+、Co2+或Ni2+等）和去铁敏会抑制PHD2的催化活性，使羟基化反应受影响；（3）抗坏血酸：在常条件下，抗坏血酸可以增强PHDs的活性、促进HIF-1α羟基化反应；（4）TCA循环（三羧酸循环）中间产物：一些TCA循环中间产物（如琥珀酸）的积累会抑制PHDs 的活性，使HIF含量上调；（5）一氧化氮：一氧化氮在结构上与氧分子相近，在常氧条件下通过与脯氨酰羟化酶结合来阻断羟基化反应，稳定HIF含量。

由于时间及条件有限，本研究参考了Ivan[8]等人的方法进行PHD2催化HIF-1α肽段的羟基化反应。若做下一步研究的话，可以优化各辅因子在反应体系中的浓度，并探索最佳反应条件（反应体积、温度、时间等）。